슈퍼옥사이드로 구성된 새로운 하이브리드 단백질

Scientific Reports 13권, 기사 번호: 6892(2023) 이 기사 인용

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슈퍼옥사이드 디스뮤타제 활성 Cu(II) 복합체(CuST)와 라이소자임(CuST@lysozyme)으로 구성된 새로운 하이브리드 단백질이 준비되었습니다. 분광학적 및 전기화학적 분석 결과, CuST가 리소자임에 결합하는 것이 확인되었습니다. 우리는 0.92 Å 분해능에서 CuST@lysozyme의 결정 구조를 결정했으며, 이는 리소자임의 His15 이미다졸 그룹이 적도 위치에서 CuST의 Cu(II) 중심에 결합한다는 것을 나타냅니다. 또한, CuST는 Thr89 하이드록실 그룹의 약한 축 배위와 Arg14 잔기의 구아니디늄 그룹과 CuST의 하이드록실 그룹 사이의 수소 결합에 의해 위치에 고정되었습니다. 또한, CuST와 라이소자임의 조합은 CuST의 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 활성을 감소시키지 않았습니다. 스펙트럼, 전기화학, 구조 연구 및 양자 화학 계산을 기반으로 CuST@lysozyme에 의해 촉매되는 O2 불균형 메커니즘이 제안되었습니다.

호기성 유기체는 호기성 호흡을 통해 생명을 유지하는 데 필요한 에너지를 생산합니다. 하이드록실 라디칼(·OH), 일중항 산소(1O2), 과산화수소(H2O2), 과산화물(O2-)과 같은 활성 산소종(ROS)은 이 과정에서 피할 수 없는 부산물입니다. 이러한 ROS는 지질, 탄수화물, 호르몬, 단백질 및 핵산과 같은 생체분자에 심각한 산화 손상을 일으킵니다. 이러한 ROS 중에서 O2-는 전자 수송 시스템, 식세포 과정, 효소 산화 및 헤모글로빈 및 미오글로빈과 같은 산소 운반 단백질에 의해 생성됩니다1. 양성자 조건에서 O2–는 양성자(H+)와 반응하여 ·OH 및 H2O22와 같은 다른 ROS를 생성합니다. 따라서 호기성 유기체의 경우 O2- 제거가 최우선 과제입니다. O2를 제거하고 O2에 의해 유발되는 산화 손상을 피하기 위해 호기성 유기체는 SOD(과산화물 제거효소)로 알려진 금속효소를 보유합니다. SOD는 반응식 (1)에서 볼 수 있듯이 O2-가 H2O2와 O2로 불균형화되는 것을 촉매합니다.

SOD는 산화 손상으로부터 생체분자를 보호하는 데 중요한 역할을 하기 때문에 유기체의 기대 수명은 효율적인 SOD 활동에 달려 있습니다. SOD 활동이 높은 유기체는 사망률이 낮고 그 반대도 마찬가지입니다3. 금속 이온은 SOD의 활성 중심에 있으며, 이는 각각 반응 (2)와 (3)을 통해 H2O2와 O2를 생성하기 위해 O2의 불균형을 촉매합니다.

활성 센터에 존재하는 금속 이온을 기준으로 SOD는 네 가지 범주로 분류됩니다. Ni, Fe, Mn, Cu 및 Zn을 포함하는 SOD는 NiSOD4,5,6,7,8, FeSOD9,10,11,12,13, MnSOD14,15,16,17,18,19 및 CuZnSOD20으로 알려져 있습니다. 각각 21,22. 본 연구에서 우리는 활성 중심에 Cu(II) 및 Zn(II) 이온을 포함하는 가장 널리 퍼진 CuZnSOD에 중점을 두었습니다. 아래 반응 (4)와 (5)에서 볼 수 있듯이 Zn(II) 이온은 활성 중심 주변의 2차 배위 구조를 고정하는 반면23 Cu(II) 이온은 O2-의 불균형 반응을 촉매합니다.

천연 CuZnSOD를 O2 제거제로 사용하려면 높은 비용과 불안정성과 같은 문제를 해결해야 합니다24. 이러한 맥락에서 저분자량의 Cu(II) 복합체가 기능성 SOD 모델로 보고되었습니다. 이러한 Cu(II) 복합체 중에서 살리실산을 리간드로 배위하는 복합체는 기능성 SOD 모델로 보고되었습니다. 우리 그룹은 또한 페놀레이트와 L-아미노산 부분으로 구성된 Cu(II) 복합체를 보고했습니다. 그러나 이러한 배위 화합물은 리간드에서 Cu(II) 이온이 방출된 후 생체분자에 독성을 나타낼 수 있습니다. 이 문제를 해결하기 위해 우리는 단백질의 강력한 Cu(II) 이온 결합 능력에 중점을 두었습니다.

본 연구에서는 첫 번째 접근 방식으로 안정성과 결정성 때문에 선택한 라이소자임과 기능성 SOD 모방 Cu(II) 복합체로 구성된 하이브리드 단백질의 형성을 조사했습니다. 이 SOD 모방 하이브리드 단백질은 기능성 SOD 모델 Cu(II) 복합체의 생체 적합성과 안정성을 향상시킬 것으로 예상되었습니다.

14), forming an imidazolate anion. When the pH of the solution is between 6 and 14, the imidazole group is neither protonated nor deprotonated. Therefore, in pH 7.0 solution, imidazole can bind to the Cu(II) center in the neutral state. Although this UV–vis spectral behavior was not sufficiently quantitative to determine the binding constants, the spectral change was qualitatively saturated. In addition, CuST-Imi was obtained through the reaction of CuST with 1 eq. of imidazole in good yield (77.8%). Based on these results, we presume that CuST binds sufficient well with the imidazole group of His15./p>

> 2000 μM). Both CuST-Imi and CuST showed higher SOD activities than CuCl2, indicating that the SOD activity of the CuST unit was retained, even when CuST was bound to lysozyme. These results indicated that lysozyme acquired SOD activity by forming a composite with CuST. Unfortunately, the SOD activity of the CuST unit did not improve upon binding to lysozyme. This is because the hydroxyl group of CuST forms hydrogen bonds with the guanidinium group of Arg14, neutralizing the positive charge. As a result, O2– ions cannot form strong electrostatic interactions with the guanidinium group of Arg14, although hydrogen bonds play an important role in fixing the CuST unit to lysozyme./p>

was compared to the expected S(S + 1) for the spin state (doublet state). In all the calculations performed, the spin contamination was found to be less than 3% and therefore negligible. The structures of the complexes were visualized using ChemCraft software Ver. 1.660. To model the optical properties, the 120 lowest excitation states were chosen. An increasing number of excitations resulted in bands in the deep-ultraviolet region of the spectrum, which was not the target region of this research. Calculations were performed for the isolated molecules and molecules in the solvent medium (water). A polarizable continuum model was adopted for the latter61. The molar absorptivity, ε (L mol−1 cm−1), was calculated using the GaussSum 3.0 program package62. The g-tensor and hyperfine coupling constants (A-tensor) were calculated using the ORCA 5 program package63. A hybrid Becke three-parameter functional (B3LYP) was used in combination with the Pople basis set (6-311G(d,p)). The A-tensor was obtained as the sum of three contributions: the isotropic Fermi contact (AFC), anisotropic dipolar (\({\mathrm{A}}_{x, y, z}^{D}\)), and spin–orbit coupling term \({(\mathrm{A}}_{x,y,z}^{SO})\). This approximation reproduces the target parameters64,65./p>